千师慧问题详情页
  • 提问标题: 如何做免疫组织化学IHC实验

    提问内容:


    问题答复1: 一、脱蜡水化:切片在脱蜡前,放在APES(防止脱片用的,缺点是有低毒性) 1:50 丙酮溶液中浸泡3分钟,晾干或60°C恒温箱中烘烤20分钟,然后将组织切片置于二甲苯中浸泡10min,更换二甲苯再浸泡10min,无水乙醇浸泡 10min,更换无水乙醇再浸泡10min,然后依次95%乙醇,70%乙醇,50%的乙醇各5min,最后用蒸馏水浸泡5min;原理:①二甲苯的作用:溶解蜡块,起到脱蜡的作用;②梯度酒精是为了除去对人体有害的二甲苯,但高浓度的酒精时间过长会导致组织细胞变形,影响抗原的表达,也会影响到组织在显微镜下的光学形态,所以用梯度酒精;③保持玻片在自来水中,直到准备进行抗原修复。任何时候都不应该使玻片干燥,干燥会导致非特异性抗体结合,从而出现高背景染色;技巧:①观察是否脱蜡完全,因为石蜡是不溶于水的,如果石蜡脱不完全,水流上去会模糊还有滞流感。原则就是彻底、干净、完全的脱去石蜡。二、清洗:先用用蒸馏水温柔的冲洗一会,更换PBS冲洗5min,再用PBS冲洗5min;注意:冲洗时尽量温柔,可以多冲洗一会;①可以将玻片放在卧式缸里,在摇床上轻轻晃3-5min,重复2-3次三、抗原修复:(此步骤根据实验可增减)将切片放入盛有0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续 10~15分钟取出容器,室温冷却30分钟;注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型;原理:①枸橼酸缓冲液,是抗原修复液的一种,一部分抗体使用这种修复液修复的效果最好。②对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须经过抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加抗原检测率。修复的方法有很多种,我采用的是热修复。对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。③修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种我们这次实验用的枸橼酸缓冲液,此外还有EDTA缓冲液。(具体的可以查阅相关资料,大量的:中性的、高pH的等)。四、消除内源性过氧化物酶的活性用3%H2O2滴加到切片上,封闭5-10min去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗2-5min,冲洗三次。特别说明:在一些过氧化物丰富的组织里面(肝脏、胎盘、血管瘤、急性炎症组织等)3%H2O2也不能完全消除内源性的过氧化物,改进的方法就是先用3%H2O2阻断10min,再用0.5%的高碘酸溶液阻断10min。五、封闭:用和二抗来源一致的血清在保湿盒中于37℃孵育15~30min,然后甩去封闭用血清,勿洗;注意:封闭时间根据具体实验调整;封闭液一般选用5%BSA或与二抗来源一致的血清,切记是BSA,不是PBS.很多论坛写的是PBS,太坑了。①使用血清好还是BSA好? 答:第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合,从而导致背景过高,因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合,从这点看,BSA和血清没有明显区别。第二是待检样本中可能会有Fc受体,可以和抗体恒定区结合,与抗体特异性无关,封闭血清中有抗体,因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。BSA则无法封闭Fc受体。六、一抗孵育:滴加适当比例稀释的一抗,将切片放在保湿盒中于4℃冰箱中过夜孵育或者温箱37℃孵育1-2个小时。小技巧:一抗孵育可以是4℃冰箱中过夜孵育,也可以选择37℃孵育1-2小时。关键就是温度要控制恒定。普遍情况下都选择4℃冰箱中过夜孵育,因为它的温度稳比室温要稳定。注意:适当比例稀释是可以查到的,很多说明书或该公司网站产品详情页都有,实在不行你直接打电话去问公司的技术支持,他们给的建议更适合他们的产品,可别想当然。七、清洗:过夜后的切片用PBS冲洗,冲洗3次;注意:一定要单独冲洗,多个片子防止交叉反应造成污染;温柔冲洗,防止切片的脱落 八、二抗孵育:滴加生物素标记的二抗在保湿盒中于37℃孵育30分钟。加之前吹干净标本上的水(可以用吸水纸沿着材料周围画圈把水吸干)注意:其实抗体孵育过程都是一致的目的都是结合,所以一定要保证在一个环境稳定和稳定恒定的条件下进行,你也许会在实验室发现一个大纸条写着实验中,勿动!九、清洗:切片用PBS冲洗2min,冲洗3次;十、滴加适当比例稀释的HRP标记的亲和素,再37℃孵育20min十一、清洗:用PBS冲洗2min,冲洗3次十二、显色:加入显色剂显色,选择DAB(快速滴入,观察染色情况)根据显微镜下的观察决定终止显色的时间一般都在3-10min左右,最常用5min。十三、自来水冲洗:自来水充分冲洗10-15min,注意:冲洗的时候要注意水流不要太大,缓慢的冲洗。十四、复染:加一大滴苏木精复染,细胞核蛋白几秒就可以,细胞浆或者细胞膜蛋白需要然20-30S,自来水冲洗,再用PBS返蓝5min。注意:①复染的时间是需要摸索的,这个与苏木精的配制时间有关。如果是第一次做,可以请教一下实验室的老师问一下经验,自己在多备两个片子,摸索感受一下。②若试验目的只是想说明组织中蛋白表达的有无、量的多少和颜色的深浅,那就不需要苏木素复染;若实验目的是想看组织切片蛋白定位在胞核还是胞浆,那就最好苏木素复染;③复染试剂的选择与显色系统相关联?如果是AEC和DAB系统,那么显色应该是红色和棕黄色,这样你用苏木素复染核就不会影响阳性细胞的观察,更何况你所检测的抗原位于胞浆中呢。如果你用BCIP/NBT系统显色,则显色为紫黑色,此时你复染核就不能用苏木素了,因两者的色泽相似。你可以选用甲基绿溶液复染核,这样核为鲜艳的兰绿色,不容易与BCIP/NBT系统相混淆了。④关于返蓝的选择,我估计大家看到很多不同选择(有水、氨水、PBS、饱和碳酸锂等等)。本质来说,返蓝的原理是苏木素遇碱变蓝色,所以以上这几种都是偏弱碱性的物质。十五、脱水透明依次用50%, 70%, 95%酒精各5min浸泡切片,最后用100%酒精浸泡10min,更换酒精浸泡10min,最后用二甲苯浸泡10分钟,更换二甲苯,再浸泡10min;注意:梯度酒精的作用:脱水,以便片子长期保存;二甲苯是为了使片子更加透明;十六、封片捞出,用树脂封片,一滴/张,在其上盖上小玻片封好的组织切片,放入超净台中,打开抽风,冲一段时间,最后把切片放在窗台上凉2-3天,就可收起来。注意:封片用的材料与显色系统相关:DAB显色的石蜡切片免疫组化封片用中性树脂或者中性快干胶都可以啊,AEC显色的用水溶性的封片剂就可以,免疫荧光的话需要专门的防脆变的封片剂或者用甘油也行(但是保存时间很短)。


    回答问题: